У цианобактерий прочная клеточная стенка, поэтому протоколы для прокариот вроде E.coli здесь не годятся. Обработка клеток NaI, лизоцимом, STEТ и так далее направлена на то, чтобы разрушить эту стенку.
Протоколы многократно опробованы на Synechocystis. Первый (с NaI) обычно используется в максипрепах, однако мы пробовали модифицировать его для работы в эппендорфах и с меньшим количеством культуры, уменьшив соответственно все параметры. При отстутствии нужной центрифуги так можно делать, но по нашему опыту эффективность метода снижается.
Второй (со STET) лучше использовать для работы с небольшим объемом культуры. Плюс — отстутствие в протоколе фенола, при этом ДНК получается довольно чистая.
Полученная ДНК годится для основных молекулярно-биологических исследований (ПЦР, Саузерн и т.д.). Выход сильно варьирует в зависимости от штамма, состояния культуры и так далее, так в общем для всех не скажешь.
Работа занимает приблизительно 1 день. В принципе, можно прерваться и закончить работу на другой день на стадиях:
(1) п.3 — супер слить, а осадки заморозить на -20oC или -80oC;
(1) п.16 — можно оставить в морозилке на ночь;
(2) п.5 — супер слить или отсосать вакуумным насосом, осадки заморозить на -20oC;
(2) п.18 — можно оставить в холодильнике на ночь;
(3) п.3 — супер слить, а осадки заморозить на -20 или -80oC;
(3) п.13 можно убрать на ночь на -20oC.
По пунктам
(1)
п. 1.
Для Synechocystis обычно занимает 36-48 часов при засеве с плотностью ОД730=0.1-0.2, среда BG-11, 34oC, при постоянном барботировании воздухом с СО2 (1% vol/vol), освещение 70µmol фотонов m-2*s-2.
Вообще, скорость роста и качество культуры сильно зависит от того, какая цианобактерия, какой штамм, в каком состоянии. Главное — дорастить ее до физиологического оптимума. Так-что этот вопрос каждый экспериментатор решает сам, исходя из свойств культуры.
п. 13.
Должен получиться вязкий зеленый лизат. Вязкость можно уменьшить пипетированием (для этого нужно использовать обрезанный носик на 1ml). Если лизат непрозрачный, скорее всего, изначально было взято слишком много клеточной культуры; можно попробовать поставить на 37oC еще на 20'.
(2)
п. 2.
Обычно это делается в 50ml пластиковых пробирках, но можно открутить в центрифужных стаканах на 100-250ml и так далее, главное — собрать клетки.
п. 4.
Сначала добавить 0.5ml, ресуспензировать, затем добавить еще 1ml.
(3)
п. 18 — 22.
Эти пункты не обязательны, если ДНК нужна для экспериментов, где РНКаза в растворе не мешает.