По нашему опыту основным преимуществом хроматографической очистки перед седиментационными методами является больший выход высокомолекулярной mRNA (особенно опасен в этом отношении метод, связанный с гибридизацией mRNA c Bio(dT)12-20 с последующей адсорбцией на стрептавидин-парамагнитные частицы - в наших руках он давал приличный выход лишь до ~3kb).
Приготовление колонки
суспензировать соответствующее количество oligo (dT) cellulose в стерильной H2O (1g -> 2.5-3.5ml);
декантировать по крайней мере дважды
(например, для 0.1g oligo(dT) cellulose => ресуспензировать в ~12ml H2O в 15ml ЦФ-пробирке, дать осесть под действием силы тяжести ~10', снять надосадочную жидкость, повторить);
заполнить колонку:
* вылить суспензию в колонку в 1xCLB (в нём пузырьки воздуха легче проходят сквозь штифт);
* дать стечь так чтобы ~1/2 колонки осталась заполненной;
Принцип хроматографии: oligo(dT), ковалентно связанная с целлюлозой, образует ds-гибриды с polyA-хвостами mRNA при концентрации соли 0.5М. Эти гибриды дестабилизируются при прогреве в низкосолевом буфере.
После одного раунда хроматографии получается ~1-4% (в зависимости от источника) от исходного количества RNA, после второго раунда (~30-60% от первого) => 0.3-2.5% от исходного количества RNA.
С 0.1g колонки можно получить ~100µg poly(A)+RNA.
Одну колонку можно использовать более 10 раз.
По пунктам
п.1-6.
oligo(dT) целлюлоза берётся из расчета: 1ml колонка на 10mg totalRNA.
Колонка должна быть по возможности широкой и короткой. Чем шире и короче колонка, тем быстрее скорость течения жидкости, а разделять хроматографические зоны при адсорбционной хроматографии не требуется.
п.8.
Этот нагрев денатурирует RNA, устраняя возможные двухцепочечные участки, которые могут сделать polyA-хвост недоступным.
п.9.
Если раствор будет слишком холодным, SDS из CLB выпадет в осадок в п. 11. растворить его в колонке чрезвычайно сложно. Придётся ее разбирать, нагревать суспензию oligo(dT) cellulose в большом объеме H2O и перенабивать колонку заново.
п.11.
В некоторых методиках рекомендуется повторно наносить материал на колонку. Судя по нашему опыту это необязательно (в случае, когда использовалась 0.1g oligo(dT) cellulose и получено 30µg poly(A)+RNA нанесение элюата на колонку во второй раз не дало дополнительного связывания. (Т.е., когда нанесли на отдельную колонку то, что не связалось в первый раз, то при элюции пика не было.) Однако, нельзя исключить, что наш результат определялся высоким качеством используемой oligo(dT) cellulose (Type 7, Pharmacia).
Элюат можно собрать и приготовить из него рибосомный маркер молекулярного веса.
п.12.
Не надо ставить перед собой задачу отмывать до тех пор, пока спектрофотометр не перестанет детектировать пик RNA. В любом случае при одном раунде очистки на колонке останется масса рибосомной RNA, приблизительно равная массе mRNA (они как-то стехиометрически ассоциируют друг с другом).
Например, пусть на 0.1g колонке чистится ~ 2.5mg тотальной RNA. Ожидаемый выход mRNA составляет ~25-100µg. Приблизительно столько же будет и рибосомной RNA. Все это будет элюировано в объеме <0.7ml. Таким образом, нас устроит такая концентрация "C" примесей, что
0.7[ml]xC<<25-100µg => C<<30µg/ml, т.е. OD260(элюируемого раствора) <<1.
п. 13.
На колонке с медным нагревателем оптимальное время подогрева 5' (при температуре воды в нагревателе 70oC);
На рис. изображена колонка с подогревом. Вся конструкция скрепляется зажимом для бумаги - "бульдог" одетым на "шубу" из фольги.
п. 14.
Предварительный (до элюции) прогрев колонки и элюция горячим буфером приводят к тому, что RNA сходит пиком ширины ~1Vcolumn, а не растягивается на ~5Vcolumn (Для 0.5ml колонки при сборе фракций по 8-10 капель (~150 µl), polyA+RNA находится во 2-4 (реже в 5) пробирках. Достаточно снять ~7 пробирок.)
Фракции собираются:
9 капель
10
10
10
4 (на случай, если что-то попадет в 5юфракцию, чтобы не брать слишком много дополнительного материала)
10
10.
п.15.
По 1 µl из каждой фракции к 100µl EB - измерять OD260на спектрофотометре.
п.24.
При высоком рН двухцепочечные нуклеиновые кислоты денатурируют. Такая отмывка гарантирует, что все, что способно гибридизоваться с oligo(dT) будет смыто с колонки.