Выделение ДНК из крови


MolBiol.ru > Методы > Геномная ДНК > Выделение ДНК из крови

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · ·

Zbio-wiki

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ИСТОРИЯ ЗООМУЗЕЯ

Выделение ДНК из крови

получить кровь из вены добровольца;
добавить 0.5M EDTA до 50mM => 1/10V;
смешать:

препарат крови с EDTA => 1V,
буфер 1 => 6V;

0^oС, 1-4h;
ЦФ 1.5krpm, 4^oС, 15';
удалить супернатант;
осадок ядер суспендировать в "буфер 2" в объеме, равном 0.8V взятого препарата крови;
добавить

proteinase K до 50µg/ml,
SDS 10% до 1%, => 1/10V;

37^oС, ON;
добавить 3.0M AcONa pH7.5 до 0.3М => 1/10V;
мягко экстрагировать нейтральным Ф, Ф:Х, Х (ЦФ 5krpm, NT, 10');
осадить NaCl/EtOH;
промыть 70% EtOH;
растворить осадок в H₂O.

MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 54331

Комментарии

Общие

Содержание DNA в лейкоцитах: 30-60 µg/ml крови.
/дополнение от Kola/
>В пункте 6 следует добавить, что когда в помещении холодно, следует получившиеся ядра два раза отмыть буфером 2 от буфера 1 путем суспендирования и перенесения в новую пробирку, а затем осаждения на центрифуге в течение 10 мин. при 3000 об/мин (30 см ротор) при комнатной температуре, а то в самом конце (в пункте 14) ДНК ни за что не будет в воде растворяться.
>В пункте 9 лучше температуру +50^OС.
>В пункте 10 и 12 для высокомолекулярных ДНК соль не обязательна.

По пунктам

п.2.

EDTA предотвращает свертывание крови. В некоторых методах для этого используют гепарин, но он является мощным ингибитором PCR и благополучно проходит сквозь всю процедуру очистки.

п.3, 4.

Triton X-100 лизирует клеточную мембрану, но не разрушает ядро. На этом этапе вскрываются кровяные клетки, от лейкоцитов остаются только ядра.

п. 5.

Осаждение ядер лейкоцитов.

п.7.

Получение суспензии ядер.

п.9.

Расщепление белков Prot.K.
Наверное предрассудок, я обычно оставляю на ночь при 37^oС, а на пару часов - при 50^oС.
После инкубации на 37^oС можно прерваться на 1-2 дня (хранить при +4^oС).

п.10.

Соль лучше добавить до фенольной экстракции, т.к. экстракция фенолом в низкосолевом буфере может быть связана со значительными потерями DNA.

Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/

Метод выделения ДНК для ПЦР из сухих пятен крови обсуждался на форуме. Работает очень быстро, достаточно прокипятить образец в воде со смолой Chelex-100 и отобрать супернатант. Используется в криминалистике.

-- как прислать био-картинку --

Дополнения, комментарии, вопросы

Люди знающие! Здесь недостаёт того, что знаете вы, но не знал или забыл автор. Этой страницей пользуются ваши коллеги. Пожалуйста, поделитесь с ними опытом. Пригодится всё, что поможет в работе.

guest: Гость /24.06.2006 15:23/

[font=Arial][size=1][color=maroon]

vb /08.08.2006 09:09/

по ряду причин пришло время (для меня) ревизии методов.
после анализа нескольких книг (в т.ч. и маниатис, это на случай реплики - "смотри в маниатисе"), протоколов коммерческих наборов и многочисленных обсуждений на молбиол (штук 30 тем просмотрел) остались вопросы.

на сегодняшний день основная задача - выделение тотальной днк из органов мышей (селезенка, гол мозг, кровь, кожа, мочевой пузырь) для детекции днк возбудителя в пцр. возбудитель - бактерия (не имеющая клеточной стенки) с внутри- и внеклеточной локализацией.

вопросы:
1. есть ли смысл использовать ГИТЦ или все-таки протеиназы достаточно (до этого работали только с протеиназойК)?
2. от момента взятия органа до момента глубокой заморозки (-70) проходит до 5 часов. есть ли смысл в использовании фиксирующих или лизирующих растворов? спирт, ацетон, тот же ГИТЦ?
3. с кровью мне все ясно, а вот для органов, особенно с достаточно жестким соединительнотканным каркасом (мочевой пузырь) достаточна ли обычная концентрация протеиназы, или стоит попробовать увеличить ее?
4. в протоколах как присутствует, так и отсутствует этап экстракции смесью фенол-хлороформ (1:1). делали и так, и так. х.з., та и не опредилился - нужен ли он? какие теоретические предпосылки имеет этот этап?
5. в некоторых протоколах используют просто хлороформ, в других хлороформ-изоамиловыйспирт (24:1). есть ли особый смысл в этой смеси?
6. свежекупленный хлороформ квалификации хч пергонять не нужно, я думаю?
7. вот еще давно мучает вопрос - в лизирующих растворах используют гуанидин изотиоцианат, а почему хлорид нельзя? у меня вот большая банка гуанидин хлорида стоит. может не стоит деньги тратить?

Guest /08.08.2006 12:19/

1. Я бы поставил вопрос наоборот. С гуанидином-то быстрее
2. ГИТЦ, а если просто детекция возбудителя, то бросьте орган в холодильник
3. ддостаточно обычной концетрации, можно увеличить время
4. Если используете протеиназу, то отмывка фенолхлороформом обязательна, и вообще в любом случае она желательна
5. я разницы не видел
6. лучше использовать "для молеулярной биологии"
7. изотиоцианат лучше лизирует, а в остальном - пофигу

Ольга Л. /08.08.2006 16:11/

Изоамиловый спирт добавляют в хлороформ, чтобы смесь не пенилась - только и всего.

vb /08.08.2006 19:48/

(Guest @ 08.08.2006 10:19)

4. Если используете протеиназу, то отмывка фенолхлороформом обязательна, и вообще в любом случае она желательна

в смысле сначала фенолом, потом фенол-хлороформом, а потом хлороформом?

перцы /09.08.2006 07:22/

Пробовали выделять ДНК мышей разными методами (в том числе и с протеиназой с отмывкой фенолом). Пришли к выводу, что лучше всего работают киты (личное мнение). Сами пользуемся китом quiagen DNeasy. Результаты лучше.
Но это опять же смотря для каких целей. При работе с данным китом можно выделять только из небольшого образца. Если же требуется выделить ДНК из целого органа, то тогда вышеописанным методом.

Кстати о концентрации протеиназы К. Увеличивать точно не нужно, следует придерживаться концентрации, указанной в протоколе. А кроме увеличения времени можно еще гомогенизатором поработать.

Anubis /15.08.2006 01:41/

(vb @ 09.08.2006 03:48)

в смысле сначала фенолом, потом фенол-хлороформом, а потом хлороформом?

Да. Причем фенол-хлороформ и хлороформ лучше повторить дважды. Так ДНК чище выходит.

vb /15.08.2006 07:35/

а куда отраву, оставшуюся после перегонки девать?
на вид и на запах она покруче фенола будет, однако.

nikolya2 /14.09.2006 15:42/

Если не мешает митохондриальная ДНК, то можно выделять еще более простым методом:
получить кровь из вены добровольца;
добавить 0.5M EDTA до 50mM => 1/10V;
добавит 0,8 V Tris Cl pH7.6 5mM (сток 1M), proteinase K до 50µg/ml,SDS 10% до 1% (1/10V) и инкубировать при 50С ночь.
А далее по Маниатису...

nikolya2 /14.09.2006 15:51/

Выделение ДНК из крови очень реальное описано в МЕТОДАХ на molbiol.ru, только обязательно см. коментарии /Kola/. 100% работает! И николя2

nikolya2 /14.09.2006 16:02/

Пункт 11 см. у Маниатиса, но изоамиловый спирт использовать не обязательно. Хлороформ можно брать и не перегнаный. Главное, чтобы перегнаным был фенол.
Пункт 12 - 96% спирт следует охладить до -20 иначе ДНК может и не выпасть в осадок. Чтобы избавиться от спирта лучше отбирать его просто пипеткой, а потом оставить в холодильнике на 1 ночь (но не более, инача ДНК потом не растворится), чтобы остатки спирта сами испарились и потом ДНК можно уже растворять в воде или хранить в сухом виде.

Guest /21.09.2006 12:14/

если в ПЦР - 20мМ КОH + 60% ПЕГ 200 потом прямо в рекциу 1:10

продается как DNAzol Direct

Guest /21.09.2006 12:28/

а если CGH на microarray - то совсем другое дело

(

Guest /21.09.2006 12:31/

а еслы для детекции 8-охоG - то вообше

((

Guest /21.09.2006 12:35/

ну точно не фенол хлороформ (8-oxoG)

Guest /21.09.2006 12:40/

поетому вопрос могно ли выделит абсолутно интактнуу "днк" ис ОРГАНА
имеет отрицателныи ответ "НЕТ"

Гость /18.10.2006 11:07/

Подскажите, а есть ли какие-либо особые условия, при которых нужно готовить раствор протеиназы К?

Guest /07.02.2007 16:40/

Коллеги и просто сотоварищи! Очень нужна метода выделения человеческой, извините за выражение

, ДНК из цельной крови, по чистоте, количеству и высокомолекулярности ДНК сравнимая с фенол-хлороформом. Типа разнообразных колонок и прочих буржуйских китов. Объем крови для выделения 5 ml. Ежели кто юзал и сравнивал, отзовитесь, плиз. Заранее всем спасибо

guest: гость /07.02.2007 20:27/

Коллега и товарищ! Обратитесь в Лаборатория Изоген по поводу набора для выделения геномной ДНК из цельной крови. Называется набор Diatom DNA Prep. Непревзойденное качество выделенной ДНК. Буржуйские киты отдыхают.

Guest /08.02.2007 12:00/

Это спасибо огромное. Только мне надо сразу из 5 мл выделять, а там, насколько я понимаю, максимум 200 мкл. Аликвотить довольно неохота, ибо образец будет не один, а сильно больше.

Guest /08.02.2007 12:58/

Для чего Вам такая прорва ДНК? Саузерны? Банк? За полчаса без центрифуги можно выделить ДНК из 1 мл цельной красной крови на магнитном сорбенте. Набор "Magnetic DNA Prep 1". Его же можно приспособить для выделения из большего объема, 2-10 мл.

Guest /08.02.2007 13:37/

Ну типа.

Спасибо, посмотрю.

Гость /19.02.2007 11:57/

ИМХО наиболее дружественный протокол выделения ДНК у наборов Promega. ДНК получается чистая, процесс занимает всего час для крови и 4-5 часов для биоптатов.

Guest /21.02.2007 13:49/

(Guest @ 08.02.2007 11:00)

я понимаю РНК на микроарреи - но зачем СТОКО ДНК ?

Гость /15.03.2007 19:00/

Гость /12.05.2007 16:25/

привет всем,

есть здесь кто-нибудь, знающий выделения ДНК из костей? сколько вы используйте костный порошок и как осаждайте ДНК? мне никак не получается осаждение ни с этанолом, ни изопропанолом?

спасибо заранее
Тамара

Ъ /13.05.2007 22:55/

(Гость @ 12.05.2007 16:25)

Вы уверены, что дело доходит до осаждения, может быть у Вас ДНК ваще не выходит из костной ткани?

Guest /14.05.2007 08:01/

(Гость @ 12.05.2007 16:25)

1: Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Nov 7;97(23):12800-3.Click here to read Click here to read Links
Molecular identification by "suicide PCR" of Yersinia pestis as the agent of medieval black death.

* Raoult D,
* Aboudharam G,
* Crubezy E,
* Larrouy G,
* Ludes B,
* Drancourt M.

Centre National de la Recherche Scientifique Unite Propre de Recherche de l'Enseignement Superieur (UPRES)-A 6020, Faculte de Medecine, Universite de la Mediterranee, 13385 Marseille, France. Didier.Raoult@medicine.univmrs.fr

Medieval Black Death is believed to have killed up to one-third of the Western European population during the 14th century. It was identified as plague at this time, but recently the causative organism was debated because no definitive evidence has been obtained to confirm the role of Yersinia pestis as the agent of plague. We obtained the teeth of a child and two adults from a 14th century grave in France, disrupted them to obtain the pulp, and applied the new "suicide PCR" protocol in which the primers are used only once. There were no positive controls: Neither Yersinia nor Yersinia DNA were introduced in the laboratory. A negative result is followed by a new test using other primers; a positive result is followed by sequencing. The second and third primer pair used, coding for a part of the pla gene, generated amplicons whose sequence confirmed that it was Y. pestis in 1 tooth from the child and 19/19 teeth from the adults. Negative controls were negative. Attempts to detect the putative alternative etiologic agents Bacillus anthracis and Rickettsia prowazekii failed. Suicide PCR avoids any risk of contamination as it uses a single-shot primer-its specificity is absolute. We believe that we can end the controversy: Medieval Black Death was plague.

Guest /14.05.2007 08:02/

(Гость @ 12.05.2007 16:25)

http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/23/12800 ( http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/23/12800 )

Guest /15.05.2007 21:57/

(Ъ @ 13.05.2007 22:55)

Вы уверены, что дело доходит до осаждения, может быть у Вас ДНК ваще не выходит из костной ткани?

как-не выходит? После 3-дневной декальцинации а потом 18-часового лизиса и центрифугирования остаётса крохотное количество порошка...Добавляю 2мл лизис-буфера и получаю 3,7мл лизата..

Ъ /15.05.2007 22:47/

(Guest @ 15.05.2007 21:57)

Декальниция должна быть с ЭГТА, а не с ЭДТА. А лизис-буфер для чего, с чем? Подробнее, пожалуйста. Используете ли Протеиназу К?
Я делаю декальцинацию с Тритоном Х100, 1%, на ночь, затем супернатант использую для сорбции ДНК на силике в присутствии с GTC. Вся ДНК, если она есть в зубной пульпе , Ваша

Guest /16.05.2007 07:04/

(Ъ @ 15.05.2007 22:47)

Декальниция должна быть с ЭГТА, а не с ЭДТА. А лизис-буфер для чего, с чем? Подробнее, пожалуйста. Используете ли Протеиназу К?
Я делаю декальцинацию с Тритоном Х100, 1%, на ночь, затем супернатант использую для сорбции ДНК на силике в присутствии с ГТЦ. Вся ДНК, если она есть в зубной пульпе , Ваша

Дк в статъе про чуму написано - СНАЧАЛА ЗУБья пескоструем в гараже
обработать

а уж потом ДНК выделять - ато СТО ПУДОВ сам-себя отпцришь

Guest /16.05.2007 07:18/

(Guest @ 15.05.2007 21:57)

Возмите "внутрьАлу " праймеры (если человекообезяна с зубами)
и в ПЦР с сигмовской Ресторазой или "ЛонгПЦР" микс от Ферментас -
ну и сразу усе увидете

Guest /16.05.2007 07:19/

(Guest @ 16.05.2007 07:18)

Restorase™ DNA Polymerase
PCR

Sigma's Restorase DNA Polymerase (R1028) is a specialty enzyme designed to facilitate repair and provide reliable amplification of damaged DNA. Extensive manipulation of DNA that results from archived samples, aged museum specimens, or samples from phenol/chloroform extraction, causes damage that interferes with accurate amplification during PCR. Restorase was developed for researchers unable to achieve amplification of damaged DNA templates when using other commercially available DNA polymerases. The ability to restore damaged or degraded DNA enables researchers to work with damaged templates that would otherwise be abandoned.

Guest /16.05.2007 07:30/

(Ъ @ 15.05.2007 22:47)

Декальниция должна быть с ЭГТА, а не с ЭДТА. А лизис-буфер для чего, с чем? Подробнее, пожалуйста. Используете ли Протеиназу К?
Я делаю декальцинацию с Тритоном Х100, 1%, на ночь, затем супернатант использую для сорбции ДНК на силике в присутствии с ГТЦ. Вся ДНК, если она есть в зубной пульпе , Ваша

Нужно сразу ПЦРитъ как тока откопал черепушку - а не по музеям бегать

1: Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Jan 16;104(3):739-44. Epub 2007 Jan 8.Click here to read Links
Freshly excavated fossil bones are best for amplification of ancient DNA.

* Pruvost M,
* Schwarz R,
* Correia VB,
* Champlot S,
* Braguier S,
* Morel N,
* Fernandez-Jalvo Y,
* Grange T,
* Geigl EM.

Institut Jacques Monod, Tour 43, 2 Place Jussieu, 75005 Paris, France.

Despite the enormous potential of analyses of ancient DNA for phylogeographic studies of past populations, the impact these analyses, most of which are performed with fossil samples from natural history museum collections, has been limited to some extent by the inefficient recovery of ancient genetic material. Here we show that the standard storage conditions and/or treatments of fossil bones in these collections can be detrimental to DNA survival. Using a quantitative paleogenetic analysis of 247 herbivore fossil bones up to 50,000 years old and originating from 60 different archeological and paleontological contexts, we demonstrate that freshly excavated and nontreated unwashed bones contain six times more DNA and yield twice as many authentic DNA sequences as bones treated with standard procedures. This effect was even more pronounced with bones from one Neolithic site, where only freshly excavated bones yielded results. Finally, we compared the DNA content in the fossil bones of one animal, a approximately 3,200-year-old aurochs, excavated in two separate seasons 57 years apart. Whereas the washed museum-stored fossil bones did not permit any DNA amplification, all recently excavated bones yielded authentic aurochs sequences. We established that during the 57 years when the aurochs bones were stored in a collection, at least as much amplifiable DNA was lost as during the previous 3,200 years of burial. This result calls for a revision of the postexcavation treatment of fossil bones to better preserve the genetic heritage of past life forms.

PMID: 17210911 [PubMed - indexed for MEDLINE]

Guest /16.05.2007 07:35/

(Guest @ 16.05.2007 07:04)

Дк в статъе про чуму написано - СНАЧАЛА ЗУБья пескоструем в гараже
обработать

а уж потом ДНК выделять - ато СТО ПУДОВ сам-себя отпцришь

1: Mol Biol Evol. 2006 Sep;23(9):1801-7. Epub 2006 Jun 29.Click here to read Links
Tracking down human contamination in ancient human teeth.

* Sampietro ML,
* Gilbert MT,
* Lao O,
* Caramelli D,
* Lari M,
* Bertranpetit J,
* Lalueza-Fox C.

Unitat de Biologia Evolutiva, Departament de Ciencies Experimentals i de la Salut, Universitat Pompeu Fabra, Barcelona, Spain.

DNA contamination arising from the manipulation of ancient calcified tissue samples is a poorly understood, yet fundamental, problem that affects the reliability of ancient DNA (aDNA) studies. We have typed the mitochondrial DNA hypervariable region I of the only 6 people involved in the excavation, washing, and subsequent anthropological and genetic study of 23 Neolithic remains excavated from Granollers (Barcelona, Spain) and searched for their presence among the 572 clones generated during the aDNA analyses of teeth from these samples. Of the cloned sequences, 17.13% could be unambiguously identified as contaminants, with those derived from the people involved in the retrieval and washing of the remains present in higher frequencies than those of the anthropologist and genetic researchers. This finding confirms, for the first time, previous hypotheses that teeth samples are most susceptible to contamination at their initial excavation. More worrying, the cloned contaminant sequences exhibit substitutions that can be attributed to DNA damage after the contamination event, and we demonstrate that the level of such damage increases with time: contaminants that are >10 years old have approximately 5 times more damage than those that are recent. Furthermore, we demonstrate that in this data set, the damage rate of the old contaminant sequences is indistinguishable from that of the endogenous DNA sequences. As such, the commonly used argument that miscoding lesions observed among cloned aDNA sequences can be used to support data authenticity is misleading in scenarios where the presence of old contaminant sequences is possible. We argue therefore that the typing of those involved in the manipulation of the ancient human specimens is critical in order to ensure that generated results are accurate.

PMID: 16809622 [PubMed - indexed for MEDLINE]

Guest /16.05.2007 07:43/

(Guest @ 16.05.2007 07:04)

Дк в статъе про чуму написано - СНАЧАЛА ЗУБья пескоструем в гараже
обработать

а уж потом ДНК выделять - ато СТО ПУДОВ сам-себя отпцришь

1: Mol Biol Evol. 2005 Oct;22(10):2040-7. Epub 2005 Jun 15.Click here to read Links
Extensive human DNA contamination in extracts from ancient dog bones and teeth.

* Malmstrom H,
* Stora J,
* Dalen L,
* Holmlund G,
* Gotherstrom A.

Department of Evolutionary Biology, Evolutionary Biology Centre, Uppsala University, Uppsala, Sweden. helena.malmstrom@ebc.uu.se

Ancient DNA (aDNA) sequences, especially those of human origin, are notoriously difficult to analyze due to molecular damage and exogenous DNA contamination. Relatively few systematic studies have focused on this problem. Here we investigate the extent and origin of human DNA contamination in the most frequently used sources for aDNA studies, that is, bones and teeth from museum collections. To distinguish contaminant DNA from authentic DNA we extracted DNA from dog (Canis familiaris) specimens. We monitored the presence of a 148-bp human-specific and a 152-bp dog-specific mitochondrial DNA (mtDNA) fragment in DNA extracts as well as in negative controls. The total number of human and dog template molecules were quantified using real-time polymerase chain reaction (PCR), and the sequences were characterized by amplicon cloning and sequencing. Although standard precautions to avoid contamination were taken, we found that all samples from the 29 dog specimens contained human DNA, often at levels exceeding the amount of authentic ancient dog DNA. The level of contaminating human DNA was also significantly higher in the dog extracts than in the negative controls, and an experimental setup indicated that this was not caused by the carrier effect. This suggests that the contaminating human DNA mainly originated from the dog bones rather than from laboratory procedures. When cloned, fragments within a contaminated PCR product generally displayed several different sequences, although one haplotype was often found in majority. This leads us to believe that recognized criteria for authenticating aDNA cannot separate contamination from ancient human DNA the way they are presently used.

Ъ /16.05.2007 12:45/

(Guest @ 16.05.2007 07:04)

Дк в статъе про чуму написано - СНАЧАЛА ЗУБья пескоструем в гараже
обработать

а уж потом ДНК выделять - ато СТО ПУДОВ сам-себя отпцришь

Все ссылки идут на этого чухонца Паабо, который заливал костяной порошок высокомолярным GTC.

В таких условиях даже экзогенная ДНК (я добавлял ДНК лямбды-моделировал) пропадала по ходу выделения, т е прилипала к кости и навечно там оставалась.

А ПЦР на древней ДНК - это отдельная тема

Guest /16.05.2007 12:50/

(Ъ @ 16.05.2007 12:45)

Все ссылки идут на этого чухонца Паабо, который заливал костяной порошок высокомолярным ГТЦ.

А ПЦР на древней ДНК - это отдельная тема

да фиг с ним Пабо

Попробывал бы он ПЦРитъ после ОБЛУЧЕНИЯ
ДНК УФ импулъсным лазером (266 нм) мощностъю в три Хиросимы

такой "ДНК " на земле нет

даже в виде нуклеотидов

Ъ /16.05.2007 13:40/

(Guest @ 16.05.2007 12:50)

да фиг с ним Пабо

Попробывал бы он ПЦРитъ после ОБЛУЧЕНИЯ
ДНК УФ импулъсным лазером (266 нм) мощностъю в три Хиросимы

такой "ДНК " на земле нет

даже в виде нуклеотидов

Ресторазу ему, Ресторазу под хвост, как миленький пойдет

Guest /18.05.2007 15:30/

(Ъ @ 16.05.2007 13:40)

Ресторазу ему, Ресторазу под хвост, как миленький пойдет

Зря ухмыляешся

Тока что приперли из Индонезии фиксированную -перефиксированную гистологию и нужно было 550 бп хитрой
бактерюхи отпцрить - так тока "Лонгмикс" от Ферментаса вытянул

Guest /18.05.2007 15:48/

(Ъ @ 16.05.2007 13:40)

Ресторазу ему, Ресторазу под хвост, как миленький пойдет

http://www.jhc.org/cgi/reprint/50/8/1005 ( http://www.jhc.org/cgi/reprint/50/8/1005 )

Ъ /18.05.2007 18:43/

(Guest @ 18.05.2007 15:30)

Зря ухмыляешся

Ну и купи себе медаль

Ты сначала отсеквенируй ампликон, а потом хвастайся. А почему не Ресторазой любимой?

Ъ /18.05.2007 19:35/

(Guest @ 18.05.2007 15:48)

http://www.jhc.org/cgi/reprint/50/8/1005 ( http://www.jhc.org/cgi/reprint/50/8/1005 )

Я сколько раз говорил тебе, что рН и высокая температура спасет мир

Guest /19.05.2007 09:49/

(Ъ @ 18.05.2007 18:43)

Ну и купи себе медаль

Ты сначала отсеквенируй ампликон, а потом хвастайся. А почему не Ресторазой любимой?

не ресторазой - потому что хреновей ферментоса у меня
получатся

а клонировать и сиквенировать - само собой

потому как праймеры - panVIBRIO

Guest /19.05.2007 11:06/

(Ъ @ 18.05.2007 18:43)

Ну и купи себе медаль

Ты сначала отсеквенируй ампликон, а потом хвастайся. А почему не Ресторазой любимой?

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlere...ubmedid=9770538 ( http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=9770538 )

Ъ /19.05.2007 12:18/

(Guest @ 19.05.2007 11:06)

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlere...ubmedid=9770538 ( http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=9770538 )

Привет

. Здесь про твой любимый ТВ тоже в древных пробах.
http://www.454.com/downloads/news-events/g...mancientdna.pdf ( http://www.454.com/downloads/news-events/geneticanalysisfromancientdna.pdf )

Guest /19.05.2007 18:49/

(Ъ @ 19.05.2007 12:18)

Привет

. Здесь про твой любимый ТВ тоже в древных пробах.
хттп://щщщ.454.цом/дощнлоадс/нещс-евентс/г...манциентдна.пдф ( http://www.454.com/downloads/news-events/geneticanalysisfromancientdna.pdf )

ты меня этим ФИННСКИМ придурком уже достал

у меня жена финнка и лютеранка
30 лет уже как веду православно-лютеранскую бойню

но победы не видно

Ъ /19.05.2007 19:39/

(Guest @ 19.05.2007 18:49)

ты меня этим ФИННСКИМ придурком уже достал

у меня жена финнка и лютеранка
30 лет уже как веду православно-лютеранскую бойню

но победы не видно

Сочувствую

. А о себе я лучше промолчу

Guest /20.05.2007 09:53/

(Ъ @ 19.05.2007 19:39)

Сочувствую

. А о себе я лучше промолчу

кстати когда я ей "научно" обясняю что все скандинавы -недоумки и кроме
Сибелиуса никого не выродили - она мне начинает туфту про Рюриков гнать

guest: оля /26.10.2007 11:28/

Привет всем! подскажите, кто-нибудь знает как выделять ДНК из сухой крови на фильтре, говорят с помощью протеиназы К. Заранее спасибо

Ъ /26.10.2007 18:06/

Не верьте тому, что говорят. Делайте по науке

http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=192722 ( http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=192722 )

Гость /06.11.2007 00:15/

А вот мне надо было выделить геномную ДНКу из лейкоцитов, да подлиннее и чтобы потом был полный перевар после рестрикции. Я тогда занимался повторами. Все методы перепробовал. Нет полного перевара. У нас в Питере всех обошел, в Молгенетику и Институт медицинской генетики съездил та же история.
Потом все же нашел способ - выделял ядра, лизировал и крутил в CsCl c этидием. ДНКа была отменного качества.

Ъ /06.11.2007 00:47/

(Гость @ 06.11.2007 00:15)

Действительно, в жизни должно быть место подвигам.

И давно это было?

pantera /12.02.2008 12:15/

Здравствуйте! Скажите пожалуйста, мне тут в кит для выделения ДНК (QIAamp DNA Mini Kits) надо добавить этанол 96-100%, и потом при выделении он тоже используется. А можно ли для этих целей использовать спирт медицинский, который выдают, или надо покупать какой-то сверх хороший, очищенный? Если да, то где его купить?
Спасибо))

Гость /29.03.2008 12:20/

Подскажите пожалуйста,где можно посмотреть именно теорию выделение днк?Сравнительный анализ методов?На русском языке

The problem /29.03.2008 13:44/

(pantera @ 12.02.2008 12:15)

да не переживайте так, медицинский- самый лучший, а уж как пьется- сказка!

Yuri K /31.03.2008 17:16/

(Guest @ 20.05.2007 08:53)

You do not need to know Alfred Nobel, of course, since your chance of getting the prize in his name are nil; but what about Jerker Porath and Christian Anfinsen, who was Norwegian by origin?

Гость /05.09.2008 05:46/

Подскажите пожалуйста, если кто пользовался набором для выделения ДНК Проба-ГС, были ли проблемы с отрицательным контролем выделения?как их решали? а то у меня в нем ДНК выделяется....

Guest1 /05.09.2008 10:43/

(Yuri K @ 31.03.2008 17:16)

Ёу до нот неед то кнощ Алфред Нобел, оф цоурсе, синце ёур чанце оф геттинг тхе призе ин хис наме аре нил; бут щхат абоут Эркер Поратх анд Чристиан Анфинсен, щхо щас Норщегиан бы оригин?

Юр , что это ты решил за норвегов тут заступатся ?

Они мне гады робота для выделения ДНК из крови до сих пор не починили

Guest /05.09.2008 12:44/

(Guest1 @ 05.09.2008 09:43)

Юр , что это ты решил за норвегов тут заступатся ?

Они мне гады робота для выделения ДНК из крови до сих пор не починили

А ты и меня уговаривал покупать...

Guest1 /05.09.2008 14:08/

(Guest @ 05.09.2008 12:44)

А ты и меня уговаривал покупать...

Ну 10 000 евро больше или меньше -какая разница

Guest /05.09.2008 14:38/

(Guest1 @ 05.09.2008 13:08)

Ну 10 000 евро больше или меньше -какая разница

Я не такой богатый чтоб покупать дешевые вещи - так любил говорить адин мой знакомый.

А что в устрицах хорошего, не понимаю...

Радимира /22.09.2008 13:01/

Подскажите пожалуйста по какой статье была составлена данная методика? Есть ли статьи в которых были бы описаны все растворы и буферы, что и зачем?

И что означают аббревиатуры ON при инкубации и NT при центрифугировании?

Ъ /22.09.2008 18:46/

(Радимира @ 22.09.2008 12:01)

О какой методике "базар"? Составы растворов к китам никто не дает. Это же секреты!

Ищите соответствующие патенты и сами вычисляйте, что хотел сказать автор патента.

guest: ммм /22.09.2008 19:45/

-О какой методике "базар"?

вы вообще то в прикрепленной теме.

Вот об этой
http://molbiol.ru/protocol/14_02.html#add ( http://molbiol.ru/protocol/14_02.html#add )

--И что означают аббревиатуры ON при инкубации и NT при центрифугировании?
ON - через ночь, в течении ночи.
NT - нормальнвая температура.

--Есть ли статьи в которых были бы описаны все растворы и буферы, что и зачем?
Почитайте Маниатиса методы молекулярного клонирования. Книжке 20 лет, но данную методику она коментирует исчерпывающе.

Ъ /23.09.2008 09:01/

(Guest1 @ 05.09.2008 13:08)

Ну 10 000 евро больше или меньше -какая разница

Когда будут отзывы о работе Норвега? Привет.

Guest1 /23.09.2008 09:29/

(Ъ @ 23.09.2008 09:01)

Когда будут отзывы о работе Норвега? Привет.

выделяю ДНК из мяса креветок - гомогенизирую мясо шаровой мелницей с детергентом - РНКаза -
Протеиназа - потом в норвега - 40 минут .
Вроде ДНК чистая - ПЦРится без проблем пока

Ъ /23.09.2008 10:20/

(Guest1 @ 23.09.2008 08:29)

Любишь ты морепродукты

Обработка РНК-зой требуется по рекомендации к роботу?

Протеиназу К еще можно терпеть.

Guest1 /23.09.2008 13:02/

(Ъ @ 23.09.2008 10:20)

Любишь ты морепродукты

Обработка РНК-зой требуется по рекомендации к роботу?

Протеиназу К еще можно терпеть.

у них там свой какой-то лизисный раствор - это просто самопалом
круд лизат

РНКазой можно и не рнказить - просто хотел посмотреть на геле

Ъ /23.09.2008 17:02/

(Guest1 @ 23.09.2008 12:02)

у них там свой какой-то лизисный раствор - это просто самопалом
круд лизат

РНКазой можно и не рнказить - просто хотел посмотреть на геле

А шарики магнитные какого цвета, черные или коричневые?
Креветки, пока до твоей мельницы дойдут, сто раз успеют протухнуть, поэтому можно смело РНК-зирование опустить.

Guest1 /23.09.2008 17:31/

(Ъ @ 23.09.2008 17:02)

коричневые , а крыветки цельнозамароженные с магазина но рнку я не
пробовал выделять потому как нужно митохондриалку пцрить и секвенировать чтоб
"бабушек" креветковых искать

Ъ /23.09.2008 20:57/

(Guest1 @ 23.09.2008 16:31)

Ну и работка у тебя.

А кроме как из креветок еще из каких образцов пробовал выделать ДНК. Как выделяется из крови, выход, ингибирование? А почему креветки, а не устрицы...

Ъ /23.09.2008 20:58/

(Guest1 @ 05.09.2008 13:08)

Ну 10 000 евро больше или меньше -какая разница

А в России это будет что-то около 15 000.

Guest /24.09.2008 09:33/

(Ъ @ 23.09.2008 19:57)

Ну и работка у тебя.

Потому как креветки около Бали

, а устрицы в Нормандии -
ну и посмотри погоду в Нормандии и на Бали

Guest /24.09.2008 09:35/

(Ъ @ 23.09.2008 19:57)

Ну и работка у тебя.

http://www.bali.ru/ ( http://www.bali.ru/ )

Guest1 /24.09.2008 10:25/

(Ъ @ 23.09.2008 20:58)

А в России это будет что-то около 15 000.

Кстати , а чем коричневые магнитики отличаются от черных

Крови у меня под рукой нет - могу попробовать на клетках лимфомы или HL-60

Ъ /24.09.2008 10:56/

(Guest1 @ 24.09.2008 09:25)

Кстати , а чем коричневые магнитики отличаются от черных

Крови у меня под рукой нет - могу попробовать на клетках лимфомы или HL-60

Практически ничем. Кристаллической структурой Fe2O3 - Fe3O4, это по части ммм. У меня получается черный, у Promega и Merk - тоже черный, а у Dynal - коричневый. Я думаю твой от Дайнал (норвеги). Короче, магнитное ядро, покрытое устойчивой пленкой силики, стекла автивированного...

Guest1 /24.09.2008 13:28/

(Ъ @ 24.09.2008 10:56)

Практически ничем. Кристаллической структурой Фе2О3 - Фе3О4, это по части ммм. У меня получается черный, у Промега и Мерк - тоже черный, а у Дынал - коричневый. Я думаю твой от Дайнал (норвеги). Короче, магнитное ядро, покрытое устойчивой пленкой силики, стекла автивированного...

Да уж "коричневые" магнитики как-то не политкорректно получается

Guest /06.01.2009 15:58/

(Ъ @ 24.09.2008 09:56)

Утверждать не буду, но по моему магнетит Fe3O4 - черный, а маггемит Fe2O3, получаемый при окислении магнетита - коричневый. Из литературы - маггемит более устойчивый и обладает суперпарамагнитнвми свойствами (но более слабыми) как и магнетит.

Sod /06.01.2009 18:16/

Я знаю это в теории, но по моему, на сколько я помню и то и то коричневое. На сколько я помню FeO чёрный. На сколько мне известно магнитные частицы получают соосаждением обоих осидов и теоретически увеличение доли FeO может привести к чёрному цвету частиц.

Guest1 /16.03.2009 11:16/

http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/37/5/e40 ( http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/37/5/e40 )

Leshiy-lyosha /27.12.2011 14:16/

А кто-нибудь знает, сколько максимально могут храниться готовые лизирующие буферы при температуре +4 С?

guest: ммм /27.12.2011 16:54/

-А кто-нибудь знает, сколько максимально могут храниться готовые лизирующие буферы при температуре +4 С?

Не корректный вопрос!

kblag /28.12.2011 11:04/

(Leshiy-lyosha @ 27.12.2011 15:16)

А кто-нибудь знает, сколько максимально могут храниться готовые лизирующие буферы при температуре +4 С?

Дольше года не хранил, но за этот период ничего с ними ужасного не происходило.

-Ъ- /28.12.2011 17:57/

(kblag @ 28.12.2011 12:04)

Дольше года не хранил, но за этот период ничего с ними ужасного не происходило.

О чем базар

, о каком лизирующем буфере идет речь?
Повторяю за Петровичем - спрашивайте поконкретнее!
Лизирующий Реагент из моего кита для выделения ДНК хранится 10 лет при комнатной температуре в темноте в недоступном для детей месте.

bee1 /28.12.2011 18:13/

(-Ъ- @ 28.12.2011 18:57)

О чем базар

базар о том , что каплю крови на промокашку делали в институте гинекологии отто в ленинграде у баранова 100 лет назад

bee1 /28.12.2011 18:17/

капля крови на промокашку - и все типатопа - шли писмом по почте

bee1 /28.12.2011 19:31/

(-Ъ- @ 28.12.2011 18:57)

О чем базар

мне насрат на тебя и на петровича - откеда ГАДЕНЫШИ НА ФОРУМЕ ?

bee1 /28.12.2011 19:41/

(-Ъ- @ 28.12.2011 18:57)