Суть реакции Random primer: DNA, которая служит матрицей денатурируется, и с ней гибридизуются случайным образом 6-нуклеотидные затравки. DNA-полимераза удлиняет их, используя радиоактивно меченые нуклеотиды.
Концентрация праймера не оказывает существенного влияния на размер образующихся продуктов.
Для эффективного синтеза различные матрицы требуют существенно различных концентраций праймера. Концентрация, которая используется в методике избыточна для большинства матриц. Избыточность праймера используется для того, чтобы обеспечить более или менее равное мечение различных участков матрицы.
Стоит обратить внимание на то, что удельная активность вновь синтезируемой DNA определяется только удельной активностью используемого радиоактивного трифосфата. Количество добавленной в реакцию матрицы роли не играет. Количество добавленной матрицы проявляется в другом:
хватит ли матрицы на то, чтобы израсходовать радиоактивно меченные дезоксинуклеотидтрифосфаты;
в конкуренции с меченной DNA в последующей гибридизации.
Чтобы получить высокое удельное включение применяются два различных подхода:
Разумный компромисс: в реакцию берётся лишь столько матрицы, сколько требуется для того, чтобы израсходовать радиоактивные трифосфаты. Допустим, взято 10µCi a[32P]dCTP с удельной активностью 3kCi/mmol, следовательно, максимально возможное количество DNA, которое можно при этом синтезировать:
(10µCi х 4х300g/mol) / 3kCi/mmol = 4ng
Видимо, резонно превысить это количество не более, чем раза в два.
Принципиальное решение проблемы: по окончании реакции матрица отделяется от синтезированной DNA. Для этого перед реакцией матрица либо иммобилизуется на твердом носителе, либо метится фотобиотином.
Оценка количества метки с помощью ручного счетчика.
Если детектор счетчика практически полностью накрывает Ваш образец, то можно считать, что он захватывает ~40% вылетевших частиц. Допустим, что счетчик показывает 1000Bq (counts per second), тогда под детектором:
В состав "STOP" входит SDS (чтобы остановить реакцию), Salmon sperm DNA (чтобы предотвратить DNA-специфическую сорбцию на spin - колонке.
п.10.
Вначале просчитать колонку вместе с элюатом, а затем убрать колонку и просчитать только элюат. Это очень быстрый, но не слишком точный (скорее качественный) метод.