Щелочной перенос применяется для положительно заряженных нейлоновых мембран (таких как HybondN+). Фиксация DNA на мембране происходит одновременно с переносом. Для нейтральных или отрицательно заряженных мембран перенос проводится в буфере с высокой ионной силой (Перенос по Southern (в буфере с высокой ионной силой).). Фиксация проводится после переноса.
зарисовать маркер;
отрезать 1/2 маркера, лишний гель, лунки, правый верхний угол геля;
измерить и записать размер геля;
качать в 0.25M HCl (+ 10' после того, как пожелтеет бромфеноловый синий);
сполоснуть H2O;
мягко качать в 0.4N NaOH ~30';
в это время подготовить:
* 3 куска ватмана 3MM по размеру геля;
* 2 больших куска ватмана 3MM - на подложку;
* мембрану Hybond N+ (размер геля + 3-5mm c каждой стороны);
* 4 ленты парафильма;
* стопку фильтровалки;
поочередно обмакнуть в 0.4M NaOH большие куски ватмана и положить их на подложку без пузырей, опустить концы в NaOH;
положить гель дном вверх (без пузырей), налить сверху немного 0.4M NaOH;
подложить рядом ленты парафильма так, чтобы мембрана не соприкоснулась с 3MM когда гель сожмется;
мембрану смочить в 0.4M NaOH, положить на гель (без пузырей);
сверху - 3 куска ватмана 3MM (нижний перед укладкой смочить в 0.4N NaOH), стопку фильтровалки, плоскую пластину и грузик (~300g для 10x10cm2геля);
перенос в 0.4M NaOH 2-16h;
зарисовать на мембране карандашом границы геля;
подписать мембрану;
прополоскать ~5' в 2хSSC;
срезать ненужные участки;
завернуть в Saran Wrap, хранить при NT или при -20oС.
Есть сообщение, что присутствие Mg2+ ингибирует связывание DNA с мембраной при dot-blottinge (даже при ~1mM Mg2+). Добавление EDTA до 100 mM перед денатурацией восстанавливает связывающую способность даже для 6mM MgCl2.
По пунктам
п. 4.
Апуринизация приводит к умеренному дроблению DNA (фрагменты большого размера (>5kbp) плохо проходят сквозь агарозу при переносе). Важно не превышать указанное время.
п. 8.
Очень удобно, когда подложка имеет размер геля. В этом случае нет нужды прокладывать парафильм в п. 10.
п. 9.
Чтобы положить гель без пузырей надо налить на подложку немного буфера для переноса.