MolBiol.ru > Методы > Бактерии > Электрокомпетентные клетки | |
|
ГЛАВНАЯ ·
ПРОЕКТ ·
СПРАВОЧНИК ·
МЕТОДЫ ·
РАСТВОРЫ ·
РАСЧЁТЫ ·
ЛИТЕРАТУРА ·
ЗАДАЧИ ·
ФИРМЫ ·
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
|
Электропорация
Приготовление электрокомпетентных клеток все дальнейшие манипуляции проводить на холоду (заранее охладить до 0oС H2O mQ и 10% glycerol): Электропорация с помощью ячеек Bio-Rad
~7x108 (BMH71-18mutS), От соли обычно можно избавиться микродиализом. Самый простой способ избавиться от фермента - нагрев (но в случае топоизомеразы {кит от Invitrogen} он не помогает). п.1. п.10. п.11. п.22. п.23. |
Смотри также: /ссылки на сетевые ресурсы/
|
Дополнение от Веремейко Татьяны (veremeiko@ngs.ru) Клетки можно готовить каждый раз перед употреблением, это бывает удобно, когда используешь метод редко или нет возможности замораживать на -70oС. --- все манипуляции проводить во льду! ---
Дополнения, комментарии, вопросы _DmitriM_ /11.01.2006 20:06/
Я получал клетки вплоть до 10^11. Методика такая же, как описано, но клетки растил до OD600 = 0.4 - 0.5, и на 500 мл культуры делал промывку охлажденной до 4 С MilliQ 3 раза по 500 мл. Потом 3 раза по 150 мл 10% глицерола. Промывка действительно играет большую роль. Чтобы уменьшить вероятность проскока при электропорации, ДНК должна быть очень чистой, но кроме того, клетки и ДНК надо несколько раз аккуратно перемешать пипетманом. _Фома_ /11.01.2006 21:08/
Искра "без причин", т.е. при нормальных клетках и чистой ДНК, проскакивает обычно в старых кюветах и, как правило, в одних и тех же. Если в кювете случился пробой, её лучше выкинуть. Гость /29.11.2006 15:07/
А вот у меня конкретный вопрос, люди, если делали, пделитесь опытом, в работе с культурами с плохопроницаемой клеточной стенкой (микобактерии, родококки est.), каких параметров выращивания клеток следует придерживаться, чтобы получить максимально компетентные клетки??? Andrey N /02.12.2006 17:23/
Что касается Rhodococcus --- очень важный вопрос: был ли вообще хоть какойт-то результат от порации при соблюдении всех ньюансов и правил; уверены ли Вы, что эта плазмида точно поддерживается в данном штамме? Если ответ - однозначно нет, то оставте попытки,- переносите коньюгацией! Phila /05.12.2006 21:37/
Сколько ни пыталась делать электропорацию - клетки потом ведут себя неадекватно или вовсе дохнут guest: Andrey N /06.12.2006 17:43/
---- Сколько ни пыталась делать электропорацию - клетки потом ведут себя неадекватно ---- А как это?? Гость /11.12.2007 02:02/
Я приготовлял электрокомпетентные клетки из DB3.1 штамма, устойчивому к токсичным эффектам ccdB гена (Invitrogen). В результате после трансформации на семи высеянных чашках выросла только одна колония. Скажите, возможно ли что данный штамм вовсе не пригоден для приготовления электрокомпетентных клеток? studstud /17.09.2008 15:28/
Трансформирую 2 мкл (ок. 300 нг) E.coli DH5-alpha плазмидой (fusion pBBR and pME), время импульса ок. 4,4 - 4,5 мс в 0,1 см кювете и либо вообше нет трансформантов, либо всего ок. 200. Одно "но" - глицерол беру 85% аптечный и разбавляю деионизатом. В чем причина??? Еще вопрос - можно ресуспендироват комп. клетки при приготовлении пипетированием? Гость /09.12.2008 03:24/
Я ресуспендировал сначала синим типом, а потом аликвотил желтым. Не рекумендуется пипетировать клетки излишне только в процессе самой электропрорации, так как это может увеличить вероятность проскока искры в кювете. guest: Гость /09.12.2008 13:40/
Рекомендую купить новые кюветы. Алмабион пока держит старую цену, но обещает поднять с нового года: guest: Гость /11.06.2009 14:44/
Кто-нибудь использует прямоугольные импульсы для порации E.coli? watchesbiz /29.12.2021 17:48/
|
ГЛАВНАЯ ·
ПРОЕКТ ·
СПРАВОЧНИК ·
МЕТОДЫ ·
РАСТВОРЫ ·
РАСЧЁТЫ ·
ЛИТЕРАТУРА ·
ЗАДАЧИ ·
ФИРМЫ ·
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
|